Konfokalni mikroskop

Iz MaFiRaWiki

(Razlika med različicami)
Različica od 15:51, 9 maj 2015
Boskok (Pogovor | prispevki)
Osnovni princip
← Prejšnja različica
Različica od 16:17, 9 maj 2015
Boskok (Pogovor | prispevki)
Zajem večih rezin
Naslednja različica →
Vrstica 47: Vrstica 47:
=== Zajem večih rezin === === Zajem večih rezin ===
-Informacijo iz preostalih ravnin pridobimo s spreminjanjem gorišča ali pa s spreminjanjem položaja vzorca v navpični smeri. Z ustrezno programsko opremo iz zajema več zaporednih rezin rekonstruiramo tridimenzionalno sliko vzorca.+Informacijo iz preostalih ravnin pridobimo s spreminjanjem gorišča ali pa s spreminjanjem položaja vzorca v navpični smeri. Z ustrezno programsko opremo iz zajema več zaporednih rezin lahko rekonstruiramo tridimenzionalno sliko vzorca.
== Ločljivost == == Ločljivost ==

Različica od 16:17, 9 maj 2015

Konfokalna ali sožariščna mikroskopija je mikroskopska tehnika, ki nadgrajuje klasično presevno mikrosopijo. Z dvema zaslonkama, postavljenima v goriščnih ravninah, omogoča osvetlitev le izbrane rezine vzorca, kar močno izboljša kontrast slike. Debelina posamezne rezine je lahko manjša od 500 nm, vzorec pa na ta način lahko opazujemo do globine več sto μm. Konfokalna mikroskopija se navadno uporablja v kombinaciji s fluorescentno mikroskopijo. V kombinaciji s fluorescentnimi označevalci pridobimo odličen kontrast z dobro razločljivimi podrobnostmi bioloških vzorcev, ki s presevno mikrosopijo ni dosegljiv.

Vsebina

Zgodovina

Prvi konfokalni mikroskop je sestavil Marvin Minsky leta 1955, a je njegov izum sprva utonil v pozabo, saj je bilo pridobivanje tridimenzionalne slike s premikanjem vzorca zelo počasno. V šestdesetih letih je nato Mojmír Petráň razvil prvi komercialni konfokalni mikroskop, ki je za hitrejše pridobivanje slike že uporabljal Nipkowov disk. Prvo znanstveno publikacijo na temo konfokalne mikroskopije je Petráň objavil leta 1967. Leta 1969 sta M. David Egger in Paul Davidovits v članku prvič opisala konfokalni mikroskop, ki je za osvetljevanje vzorca uporabljal laserski snop. Leta 1985 sta White in Amos predstavila uporabniku prijazen inštrument za tridimenzionalno lokalizacijo fluorescentnih označevalcev na osnovi konfokalnosti: prvi fluorescentni konfokalni mikroskop. Ta je postal tudi komercialno zanimiv in se v devetdesetih letih pričel s pridom uporabljati v biologiji in znanosti o materialih. Do danes se je na osnovi konfokalne mikroskopije razvilo mnogo mikroskopskih tehnik, ki ponujajo dober vpogled v biološke vzorce.

Osnovni princip

Ključni sestavni del mikroskopa sta konfokalni reži pred izvorom in pred detektorjem, ki se nahajata v ustreznih sožariščnih ravninah vzorca. Shema, kako konfokalna reža vpliva na zajem ene točke iz goriščne ravnine je predstavljena na desni. Vidimo, da reža dovoli prehod svetlobe le iz točno določene točke (gorišča), svetlobe iz ostalih točk pa reža ne prepusti.

Shema izbira ravnine s konfokalno režo. Reža prepusti le svetlobo iz gorišča (polna zelena črta), svetlobo iz ostalih točk pa zaustavi (črtkana zelena črta).
Enlarge
Shema izbira ravnine s konfokalno režo. Reža prepusti le svetlobo iz gorišča (polna zelena črta), svetlobo iz ostalih točk pa zaustavi (črtkana zelena črta).

Za razliko od optičnih mikroskopov, kjer osvetljujemo celoten vzorec hkrati, tu omejimo osvetljevanje vzorca na le eno točko v goriščni ravnini. Shema presevnega konfokalnega mikroskopa je predstavljena spodaj. Vpadno svetlobo pred vpadom na lečo omejimo z režo. Na ta način ustvarimo točkovni izvor svetlobe in omejimo zbiranje svetlobe na ustrezno točko v goriščni ravnini, kamor postavimo opazovani vzorec. Simetrično glede na mizo z vzorcem postavimo enako lečo in zaslonko na ustreznih razdaljah, tako da gorišče pade v režo druge zaslonke. S tem dosežemo, da svetimo na isto ravnino, iz katere potem svetlobo zajemamo. Od tu ime konfokalni oz. sožariščni mikroskop. S sheme je razvidno, zakaj potrebujemo drugo konfokalno režo. Brez druge reže bi zajemali svetlobo tudi iz drugih ravnin vzorca, vzbujanju katerih se, še posebno v primeru fluorescentne konfokalne mikroskopije, ne moremo izogniti. Zaradi tega dodatnega vzbujanja je pri klasični presevni mikroskopiji dobljena slika zamegljena, pri konfokalnem mikroskopu pa svetlobo iz izvengoriščnih ravnin odstranimo z drugo konfokalno režo.

Shema presevnega konfokalnega mikroskopa. Reži omejita vzbujanje in zaznavanje na točno določeno ravnino (polna zelena črta). Druga reža služi zaustavljanju svetlobe iz vzbujenih izvengoriščnih ravnin (črtkana zelena črta).
Enlarge
Shema presevnega konfokalnega mikroskopa. Reži omejita vzbujanje in zaznavanje na točno določeno ravnino (polna zelena črta). Druga reža služi zaustavljanju svetlobe iz vzbujenih izvengoriščnih ravnin (črtkana zelena črta).

Fluorescentna konfokalna mikroskopija

Shema konfokalnega mikroskopa s fluorescenco.
Enlarge
Shema konfokalnega mikroskopa s fluorescenco.

Izraz konfokalni mikroskop se navadno uporablja za kombinacijo konfokalnega mikroskopa s fluorescentnim, saj se danes večinoma uporablja na ta način. Fluorescentni konfokalni mikroskop je prikazan na skici levo. Fluorescentni označevalci svetijo pri daljši valovni dolžini (na skici zeleno) kot svetloba, s katero nanje svetimo (na skici modra). Polprepustno zrcalo na sredini je izbrano tako, da svetlobo z valovno dolžino izvora odbije, svetlobo fluorescentnih označevalcev pa prepusti. Svetloba izvora preide prvo zaslonko, se na polprepustnem zrcalu odbije in v vzorcu vzbudi fluorescentno svetlobo. Ta je čez polprepustno zrcalo prepuščena in čez drugo zaslonko vpade na kamero. Zaslonki ležita v ustreznih goriščnih ravninah. V sistem lahko dodamo še dva filtra, ki ju postavimo za izvor in pred detektor in s tem svetlobo še dodatno omejimo na točno določeno območje valovnih dolžin. Tako izboljšamo kontrast, saj poleg filtracije signala iz izvengoriščnih ravnin s konfokalnima luknjicama odstranimo še signal ostalih molekul, ki niso označene s fluorescentnimi označevalci in jih ne želimo opazovati. Na ta način postanejo označene biološke strukture zelo dobro vidne.

Svetlobni vir

Ena možnost za izbiro izvora, s katerim osvetljujemo vzorec, je laser, ki je koherenten in monokromatski izvor svetlobe. Monokromatski pomeni, da sveti le pri eni valovni dolžini. Druga možna izbira izvora je širokopasovni izvor, ki ima valovne dolžine svetlobe porazdeljene preko celotnega vidnega dela spektra valovnih dolžin in je prostorsko nekoherenten na skali, na kateri opazujemo vzorec. Kot širokopasovni izvori se uporabljajo: izvor na volframovo nitko, kvarčna halogenska luč ter obločne luči različnih elementov (ksenon, živo srebro, ogljik). Tako laserski kot širokopasovni izvor morata biti čim manj koherentna, da se izognemo popačenju slike zaradi interference med svetlobo, ki jo zaznavamo in svetlobo, ki se siplje na optičnih elementih. Ker je laser izvor koherentne svetlobe, moramo pred vpadom na optične elemente njegovo svetlobo napraviti nekoherentno.

Tvorba slike

Z zgoraj opisanim načinom zajamemo le eno točko ravnine, pri čemer smo se znebili nepotrebnega ozadja izvengoriščnih ravnin. Za zajem celotne rezine vzorca je potrebno zajeti vsako točko ravnine, kar lahko storimo na dva načina. Način zajema slike je odvisen od tega, kakšen vir bomo uporabili.

Laserski zajem

Vrstični zajem slike.
Enlarge
Vrstični zajem slike.

Z laserskim snopom se pomikamo vzdolž vrstic in pridobimo sliko vsake točke posebej. Tako vrstično zajamemo sliko celotnega vzorca (slika desno). Postopek pridobivanja celotne slike traja med 0.5 s in 2 s. Prvotna izvedba zajema slike je bila sestavljena iz premikanja mize z vzorcem prek celotnega vidnega polja in je bila uporabljena za izboljšanje kakovosti slike presevne mikroskopije.

Pri modernejših izvedbah je miza z vzorcem pri miru, kar je za opazovanje bioloških vzorcev mnogo primernejše. V tak sistem je potrebno dodati še dve zrcali, ki ju postavimo med polprepustno zrcalo in vzorec in ju nadzorujemo prek dveh sinhroniziranih galvanometrov. S tema zrcaloma določamo, katero točko v ravnini vzorca osvetljujemo.

Konfokalni disk

Konfokalni disk.
Enlarge
Konfokalni disk.


Pri konfokalnih mikroskopih s širokopasovnim izvorom uporabimo drug način zajema. Svetlobo na točno določeno točko usmerimo s konfokalnim diskom, znanim tudi pod imenom Nipkowov disk. Tak način zajema je mnogo hitrejši, saj zajem slike traja le 1 ms, in je primeren za spremljanje dinamičnih procesov.

Konfokalni disk, kot vidimo na sliki desno, je disk s serijo luknjic v obliki spirale, skozi katere lahko hkrati osvetlimo in zajamemo več točk iz želene ravnine. Konfokalni disk postavimo za polprepustno zrcalo, tako da svetloba s katero vzbujamo in svetloba s katero zajamemo sliko potujeta skozi isto konfokalno režo in imata isto optično pot. S tem zagotovimo, da bosta ravnini v kateri vzbujamo in zaznavamo res sožariščni. Ko enkrat presvetlimo konfokalni disk, pridobimo sliko z večih točk ravnine vzorca, ne pa z vseh točk. Zajem celotne ravnine vzorca poteka tako, da vsakič, ko zajamemo del slike, disk zavrtimo v sosednji set točk. Celotno ravnino vzorca posnamemo po polnem obratu diska.

Zajem večih rezin

Informacijo iz preostalih ravnin pridobimo s spreminjanjem gorišča ali pa s spreminjanjem položaja vzorca v navpični smeri. Z ustrezno programsko opremo iz zajema več zaporednih rezin lahko rekonstruiramo tridimenzionalno sliko vzorca.

Ločljivost

Pri konfokalni mikroskopiji lahko govorimo o ravninski (lateralni) in navpični (aksialni) resoluciji, ki sta omejeni z uklonsko limito. V ravnini lahko dosežemo resolucijo do 200 nm, kar je približno enako dolžini večjih nanocevk. V navpični smeri pa lahko dosežemo ločljivost okrog 500 μm, kar predstavlja najmanjšo debelino rezin, ki smo jo sposobni razločiti v optimalnih pogojih.

Resolucija je omejena z valovno dolžino vpadne svetlobo in numerično aperturo leče. Na ločljivost vplivajo tudi poravnava optičnih elementov, odprtost konfokalne reže in lastnosti vzorca.

Primerjava posnete fluorescence brez konfokalnega diska (rdeča črta) in s konfokalnimi diskom (modra črta).
Enlarge
Primerjava posnete fluorescence brez konfokalnega diska (rdeča črta) in s konfokalnimi diskom (modra črta).

Vdorna globina

Vdorna globina je globina, iz katere smo še sposobni zaznati signal, opazno večji od ozadja. Močno je odvisna od medija, v katerem je vzorec, in tipa fluorescentnih molekul, s katerimi vzorec označimo. Maksimalna globina, ki jo lahko uspemo doseči, je reda 1 mm za polprepustne vzorce in približno 100 μm za debele vzorce. Polprepustni vzorci so vzorci, ki jih lahko presvetlimo in opazujemo svetlobo, ki vzorec preide na drugo stran, čez debele vzorce pa svetloba ni prepuščena.

Uporaba

Konfokalni mikroskop v kombinaciji s fluorescentnimi označevalci je ena od vodilnih metod, ki se uporabljajo za študijo bioloških vzorcev. Eden od razlogov je dejstvo, da so celice sestavljene iz fosfolipidnih membran, v katere z lahkoto vgradimo [Wikipedija:fluorescenca|fluorescentne]] označevalce. Z njimi označimo želene strukture v vzorcu in jih s tem ločimo od okolice. Laserski zajem slike nam omogoča boljšo navpično resolucijo, zajem s konfokalnim diskom pa s svojo hitrostjo zajema omogoča spremljanje dinamičnih procesov v vzorcu.

Kot slikovna tehnika ima odlično resolucijo, ki nam ponudi podrobne informacije o zgradbi tkiv in dinamiki določenih bioloških procesov. Uporablja pa se tudi kot spektroskopska tehnika, s katero lahko analiziramo lokalno kemijsko okolico posameznih delov bioloških objektov. Iz meritev spektra svetlobe, ki jo izsevajo fluorescentni označevalci, lahko določimo tudi tip lokalnih interakcij na nivoju molekul.

Uporablja se v biologiji, fizikalni kemiji, mikrobiologiji, nevroanatomiji, nevrofiziologiji in številnih drugih področjih. Nekatere izmed raziskovalnih področij so študija zarodnih celic, hibridizacija DNA ter uporaba membranskih in ionskih označevalcev.

Napredne tehnike

Večfotonska fluorescenca in večfotonska fluorescenca s konfokalnim mikroskopom (Two Photon Confocal Fluorescence Microscopy): Tu gre za vzbujanje vzorca z laserjem, ki sveti s svetlobo dvakrat daljše valovne dolžine (vsak foton ima pol manj energije). Za vzbuditev fluorofora v tem primeru potrebujemo dva fotona, kar omeji vzbujanje vzorca na fokus objektiva, točko, kjer je intenziteta svetlobe največja. S tem smo lokalizirali vzbujanje, kar močno izboljša kontrast. Konfokalni način, le še prispeva k dodatnemu izboljšanju kontrasta.

Vpad stimuliranje emisije (STED - Stimulated Emission Depletion): To je ena od tako imenovanih super resolucijskih tehnik, pri katerem z ločljivostjo sežemo pod uklonsko limito. Pri tej tehniki vzbujeno fluorescenco v vzorcu zadušimo povsod razen v fokusu posebej v ta namen skonstruirane leče.

Svetlobno aktivirana lokalizacija (PALM - PhotoActivated Localization Microscopy) in stohastično aktivirana optična rekonstrukcija (STORM - Stohastic Optical Reconstruciton Microscopy): Ti sorodni tehniki obe temeljita na lokalizaciji posameznih fluorescentnih označevalcev. Pri obeh tehnikah zajamemo več slik na istem mestu v času. Podatke nato računalniško obdelamo, pri čemer upoštevamo Gaussovsko porazdelitev zaznavanih fotonv, s čemer uspemo lokalizirati fluorescentni označevalec na območje, ki je manjše od ukonske limite.

Fluorescenca pri totalnem odboju (TIRFM - Total Internal Refelction Fluorescence Microscopy): Pri tej tehniki izkoriščamo evanescetno polje, ki se širi v snov, če svetimo s svetlobo pod dovolj velikim kotom (kotom, ki nam da totalni odboj na snovi). Vpadni žarek se potem odbije od vzorca, evanescetno polje pa v vzorcu vzbudi fluorescenco, na območju velikem približno 10 nm. To pomeni, da je resolucija izboljšana mnogo pod uklonsko limito. Ker evanescetno polje eksponentno pojema z globino smo s tehniko omejeni na vzorce debeline 100-200 nm.


Zajem življenjskega časa fluorescence (FLIM - Fluorescence Lifetime Imaging): Ta tehnika je drugačna od zgoraj naštetih, saj poleg namesto merimo življenjski čas fluorescence. Življenjski čas fluorescence merimo s kratkimi močnimi pulzi svetlobe in merimo čas, ki ga vzorec porabi tudi sam s pulzom zasveti. Ker ne opazujemo intenzitete, s tem zmanjšamo vpliv sipanja svetlobe na tkivu in posledično izboljšamo kontrast na sliki, ki je namesto z intenziteto obtežena z življenjskim časom fluorescence.


Večfotonska fluorescentna mikroskopija.
Enlarge
Večfotonska fluorescentna mikroskopija.
PALM mikroskopija.
Enlarge
PALM mikroskopija.
STED mikroskopija. Primerjava s sliko konfokalnega mikroskopa.
Enlarge
STED mikroskopija. Primerjava s sliko konfokalnega mikroskopa.
FLIM mikroskopija.
Enlarge
FLIM mikroskopija.

Glej tudi

Viri

Osebna orodja