Konfokalni mikroskop

Iz MaFiRaWiki

(Razlika med različicami)
Različica od 15:15, 2 maj 2015
Boskok (Pogovor | prispevki)
Zajem večih rezin
← Prejšnja različica
Različica od 15:21, 2 maj 2015
Boskok (Pogovor | prispevki)
Ločljivost
Naslednja različica →
Vrstica 65: Vrstica 65:
== Ločljivost == == Ločljivost ==
-Pri konfokalni mikroskopiji lahko govorimo o ravninski (lateralni) in navpični (aksialni) resoluciji, ki je omejena z +Pri konfokalni mikroskopiji lahko govorimo o ravninski (lateralni) in navpični (aksialni) resoluciji, ki sta omejeni z [[Wikipedija:Uklonska limita|uklonsko limito]]. V ravnini lahko dosežemo resolucijo do 200 nm, kar je nekje dolžina
-[[Wikipedija:Uklonska limita|uklonsko limito]]. V ravnini lahko dosežemo resolucijo do ?<math> \mu \textrm{m}</math>. To pomeni da v ravnini slike ločimo objekte manjše kot ?. V navpični smeri pa +večjih nanocevk. V navpični smeri pa lahko dosežemo ločljivost manjšo kot 500 <math>\mu \textrm{m}</math>, kar predstavlja najmanjšo debelino rezin, ki smo jo sposobni doseči v optimalnih pogojih.
-lahko dosežemo ločljivost manjšo kot 0.5 <math>\mu \textrm{m}</math>, kar predstavlja najmanjšo debelino rezin, ki smo jo +
-sposobni doseči. +
-Resolucija je omejena z valovno dolžino vpadne svetlobo in [[Wikipedija: Numerična apertura|numerično aperturo]] leče.+Resolucija je omejena z valovno dolžino vpadne svetlobo in [[Wikipedija: Numerična apertura|numerično aperturo]] leče. Seveda pa na ločljivost vpliva poravnava optičnih elementov, odprtost konfokalne reže in lastnosti vzorca.
== Vdorna globina == == Vdorna globina ==

Različica od 15:21, 2 maj 2015

Konfokalna mikroskopija ali sožariščna mikroskopija je mikroskopska tehnika, ki nadgrajuje klasično presevno mikrosopijo. Omogoča osvetlitev in zajem le ene rezine vzorca, kar posledično izboljša kontrast slike. Zajemanje posameznih rezin omogoča tridimenzionalno rekonstrukcijo vzorca do globine več sto μm, z aksialno resolucijo, ki seže pod 500 nm. To pomeni, da so rezine, ki jih zajamemo debele manj kot 0.5 μm. Konfokalna mikroskopija se ponavadi uporablja v kombinaciji s fluorescentno mikroskopijo. V kombinaciji s fluorescentnimi označevalci pridobimo odličen kontrast z dobro razločljivimi podrobnostmi bioloških vzorcev, ki s presevno mikrosopijo ni dosegljiv.

Vsebina

Zgodovina

Nastajanje korpusa znanja na čemer sloni današnja konfokalna mikroskopija je nastajalo med leti 1957 in 1985. Leta 1985 sta White in Amos predstavila uporabniku prijazen inštrument za tridimenzionalno lokalizacijo fluorescentnih označevalcev na osnovi konfokalnosti. Do leta 1988 je povpraševanje po podobni opremi tako naraslo, da se je ameriška znanstvena fundacija odločila financirati dva dnevni simpozij, kot del vsakoletnega srečanja združenja ameriških mikroskopistov. Prispevki s tega srečanja tvorijo jedro knjige Handbook of Biological Confocal Microscopy avtorja James B. Pawleya, ki je danes tako rekoč biblija konfokalne mikroskopije in je bila prvič izdana leta 1989. Zaradi velikega povpraševanja je bila prvič ponatisnjena leta 1990, drugič pa v močno dopolnjeni izdaji leta 1995. Do danes se je na osnovi konfokalnega mikroskopa razvilo mnogo čudovitih tehnik, ki ponujajo dober vpogled v biološke vzorce.

Osnovni princip

Ključni sestavni del mikroskopa sta konfokalni reži pred izvorom in pred detektorjem, ki se nahajata v ustreznih sožariščnih ravninah vzorca. Shema, kako konfokalna reža vpliva na zajem ene točke iz žariščne ravnine je predstavljena na desni. Vidimo, da reža dovoli prehod svetlobe le iz točno določene točke (gorišča). Svetlobe iz ostalih točk pa reža ne prepusti.

Shema izbira ravnine s konfokalno režo. Reža prepusti le svetlobo iz gorišča (polna zelena črta), svetlobo iz ostalih točk pa zaustavi (črtkana zelena črta).
Enlarge
Shema izbira ravnine s konfokalno režo. Reža prepusti le svetlobo iz gorišča (polna zelena črta), svetlobo iz ostalih točk pa zaustavi (črtkana zelena črta).

Za razliko od optičnih mikroskopov, kjer osvetljujemo celoten vzorec hkrati, tu omejimo vzbujanje vzorca na le eno točko goriščne ravnine. Shema za presevnem konfokalni mikroskop je predstavljena spodaj.

Vpadno svetlobo z režo pred lečo omejimo, tako da izvira le iz ene točke in posledično omeji fokusacijo svetlobe na ustrezno goriščno ravnino. Simetrično glede na mizo z vzorcem postavimo enako lečo na enako razdaljo. Za lečo na ustrezno mesto postavimo drugo konfokalno režo in s tem dosežemo, da svetimo na isto ravnino, iz katere potem svetlobo zajemamo. Od tu ime konfokalni, ali sožariščni mikroskop. S sheme je razvidno, zakaj potrebujemo drugo konfokalno režo. Brez druge reže, bi zajemali svetlobo tudi iz drugih ravnin, katerih vzbujanja se ne moremo izogniti. Z lečo sfokusiramo svetlobo v eno točko žariščne ravnine, kjer je potem tudi intenziteta najvišja, ampak se pri tem ne moremo izogniti vzbujanju izvenžariščnih ravnin nad in pod osvetljevano goriščno ravnino. To vzbujanje ima obliko stožca in prispeva k ozadju na sliki. Tega dodatnega ozadja se znebimo z drugo konfokalno režo.

Shema presevnega konfokalnega mikroskopa. Reži omejita vzbujanje in zaznavanje  na točno določeno ravnino (polna zelena črta). Druga reža služi zaustavljanju svetlobe in vzbujenih izvengoriščnih  ravnin (črtkana zelena črta).
Enlarge
Shema presevnega konfokalnega mikroskopa. Reži omejita vzbujanje in zaznavanje na točno določeno ravnino (polna zelena črta). Druga reža služi zaustavljanju svetlobe in vzbujenih izvengoriščnih ravnin (črtkana zelena črta).

Fluorescentna konfokalna mikroskopija

Shema konfokalnega mikroskopa s fluorescenco.
Enlarge
Shema konfokalnega mikroskopa s fluorescenco.

Prednosti konfokalnega mikroskopa se v polni meri izrazijo šele v kombinaciji s fluorescetno mikroskopijo. Pod geslom konfokalna mikroskopija ponavadi najdemo kombinacijo konfokalnega mikroskopa s fluorescenco, saj se v tej kombinaciji večinoma uporablja danes. Pri kombinaciji fluorescence s konfokalnim mikroskopom izkoriščamo dejstvo, da fluorescentni označevalci svetijo pri daljši valovni dolžini (npr. zeleni), kot jo ima svetloba s katero nanje svetimo (npr. modro). V tem primeru je lahko del optične poti svetlobe za vzbujanje in za zaznavo enak, kot je prikazano na shemi levo. Ker imata vzbujevalna svetloba in svetloba, ki jo zaznavamo, drugačni valovni dolžini lahko ločimo žarka s polprepustnim zrcalom. Polprepustno zrcalo svetlobo iz izvora odbije proti vzorcu, svetlobo iz vzorca pa prepusti proti detektorju. Dodamo lahko še dva filtra, ki jo postavimo za izvor in pred detektor in s tem svetlobo še dodatno omejimo na točno določeno območje valovnih dolžin. Tako pridobimo na kontrastu, saj poleg filtracije signala iz izvenigoriščnih ravnin s konfokalnima luknjicama, odstranimo še signal ostalih molekul, ki niso označene s fluorescentnimi označevalci in jih ne želimo opazovati. Na ta način postanejo označene biološke strukture zelo dobro vidne.

Svetlobni vir

Ena možnost za izbiro izvora s katerim osvetljujemo vzorec je laser, ki je koherenten in monokromatski izvor svetlobe. Monokromatski pomeni, da sveti le pri eni valovni dolžini. Druga možna izbira izvora je širokopasovni izvor, ki sveti preko celotnega vidnega dela spektra valovnih dolžin in je praviloma nekoherenten na skali na kateri opazujemo vzorec. Širokopasovni izvor želimo imeti čim bolj nekoherenten, da se izognemo popačenju slike zaradi interference med svetlobo, ki jo zaznavamo in svetlobo, ki se siplje na optičnih elementih. Kot širokopasovni izvori se uporabljajo: izvor na volframovo nitko, kvarčna halogenska luč ter obločne luči različnih elementov (ksenon, živo srebro, ogljik). Obločne luči iz različnih elementov imajo različne lastnosti vzbujevalnih spektrov.

Tvorba slike

Z zgoraj opisanim načinom lahko zajamemo le eno točko ravnine, pri čemer smo se znebili nepotrebnega ozadja izvengoriščnih ravnin. Za zajem celotne rezine vzorca je potrebno zajeti vsako točko ravnine, kar lahko storimo na dva načina. Način zajema slike je odvisen od tega, kakšen vir bomo uporabili.

Laserski zajem

Vrstični zajem slike.
Enlarge
Vrstični zajem slike.

Z laserjem vrstično zajamemo sliko celotnega vzorca (slika desno), vsako točko slike posebej. Zajem celotne slike traja med 0.5 s in 2 s. Prvotna izvedba zajema slike je bila sestavljena iz premikanja mize z vzorcem prek celotnega vidnega polja in je bila uporabljena za izboljšanje kakovosti slike presevne mikroskopije.

Pri modernejših izvedbah je miza z vzorcem pri miru, kar je za opazovanje bioloških vzorcev mnogo primernejše. Ta izvedba je možna v kombinaciji s fluorescentno mikroskopijo, ko svetloba s katero vzbujamo in svetloba, ki jo zaznavamo nimata iste valovne dolžine. V tak sistem je potrebno dodati še dve zrcali, ki ju kontroliramo prek dveh sinhroniziranih galvanometrov, s katerima določamo katero točko v ravnini vzorca osvetljujemo. Ti dve zrcali postavimo pred vzorec.

Konfokalni disk

Konfokalni disk.
Enlarge
Konfokalni disk.


Kadar uporabimo širokopasovni izvor uporabimo drug način zajema s konfokalnim diskom, znanim tudi pod imenom Nipkow disk. Tak način zajema je mnogo hitrejši, zajem slike traja 1 ms, in je primeren za spremljanje dinamičnih procesov.

Konfokalni disk, kot vidimo na sliki desno, ima serijo luknjic v obliki spirale, skozi katere lahko hkrati osvetlimo in zajamemo več točk iz želene ravnine. Konfokalni disk namesto takoj za izvor postavimo za polprepustno zrcalo, tako da svetloba s katero vzbujamo in svetloba s katero zajamemo sliko potujeta po isti optični poti, skozi isto konfokalno režo. S tem zagotovimo da bosta ravnini v kateri vzbujamo in zaznavamo res sožariščni. S tem zajamemo več točk ravnine hkrati ne pa vseh. Zajem vseh točk poteka tako, da vsakič, ko zajamemo del slike, disk zavrtimo v sosednji set točk. Po polnem obratu diska, bomo posneli celotno ravnino vzorca.

Zajem večih rezin

Informacijo iz preostalih ravnin zajamemo s spreminjanjem gorišča ali pa s spreminjanjem položaja vzorca v navpični smeri. Z ustrezno programsko opremo, lahko iz zajema več zaporednih rezin rekonstruiramo tridimenzionalno sliko vzorca.

Ločljivost

Pri konfokalni mikroskopiji lahko govorimo o ravninski (lateralni) in navpični (aksialni) resoluciji, ki sta omejeni z uklonsko limito. V ravnini lahko dosežemo resolucijo do 200 nm, kar je nekje dolžina večjih nanocevk. V navpični smeri pa lahko dosežemo ločljivost manjšo kot 500 μm, kar predstavlja najmanjšo debelino rezin, ki smo jo sposobni doseči v optimalnih pogojih.

Resolucija je omejena z valovno dolžino vpadne svetlobo in numerično aperturo leče. Seveda pa na ločljivost vpliva poravnava optičnih elementov, odprtost konfokalne reže in lastnosti vzorca.

Vdorna globina

Vdorna globina je globina iz katere smo še sposobni zaznati uporaben signal (signal, ki je zadosti večji od ozadja). To je sicer močno odvisno od medija v katerem je vzorec in tipa fluorescentnih molekul, ki jih imamo v vzorcu. Maksimalna globina, ki jo lahko uspemo doseči je ?μm.

Uporaba

Konfokalni mikroskop v kombinaciji s fluorescentnimi označevalci je ena od vodilnih metod, ki se uporablja za študijo bioloških vzorcev. Eden od razlogov je dejstvo, da so celice sestavljene iz fosfolipidnih membran, v katere z lahkoto vgradimo fluorescentne označevalce. Z uporabo konfokalnega diska pa pridobimo hitrost zajema slike, ki omogoča opazovanje dinamičnih procesov.

Kot slikovna tehnika ima odlično resolucijo, ki nam ponudi podrobne informacije o zgradbi tkiv in dinamiki določenih bioloških procesov. Uporablja pa se tudi kot spektroskopska tehnika, s katero lahko analiziramo lokalno kemijsko okolico posameznih delov bioloških objektov.

Uporablja se v biologiji, fizikalni-kemiji, mikrobiologiji, neuroanatomiji, neurofiziologiji in številnih drugih področjih. Nekatere izmed raziskovalnih področji so: študija zarodnih celic, hibridizacija DNA ter uporaba membranskih in ionskih označevalcev.

Napredne tehnike

Večino naštetih tehnik se je razvilo iz osnovne verzije konfokalnega mikroskopa v kombinaciji s fluorescenco.

Nekaj teh tehnik je: zajem življenjskega časa fluorescence (FLIM - Fluorescence Lifetime Imaging), večfotonska fluorescenca s konfokalnim mikroskopom, upad stimuliranje emisije (STED - Stimulated Emission Depletion), fluorescenca pri totalnem odboju (TIRFM - Total Internal Refelction Fluorescence Microscopy). Vsaka od naštetih tehnik nudi neko dodatno informacijo, ki je z običjano fluorescentno tehniko ne moremo pridobiti. Pri nekaterih pridobimo resolucijo pod uklonsko limito, pri drugih dodatne informacije o lokalnem okolju opazovanega mesta in pri nekaterih celo informacijo o interakcijah posameznih molekul s svojo okolico.

Viri

  • [1] James B. Pawley, Handbook of Biological Confocal Microscopy, Plenum Press, New York, 1995 (!!samo tale referenca je prav, ostale so vzorčne)
  • [2]Bass M. et al., 2010, Handbook of Optics: Volume V. 3rd ed., McGraw-Hill
  • [3]Yariv, A., 1985, Optical Electronics, 3rd ed, CBS College Publishing
  • [4] J. B. Pendry, D. Schurig, and D. R. Smith, Controlling electromagnetic fields, Science 312, 1780 (2006).
  • [5] N. I. Landy, S. Sajuyigbe, J. J. Mock, D. R. Smith, and W. J. Padilla, Perfect Metamaterial Absorber Phys. Rev. Lett. 100, 207402 (2008).
  • [6] W. Kasier and C. G. Garrett. Phys. Rev. Lett., 7:229, 1961.
Osebna orodja