Konfokalni mikroskop

Iz MaFiRaWiki

Konfokalna ali sožariščna mikroskopija je mikroskopska tehnika, ki nadgrajuje klasično presevno mikrosopijo. Od navadnega mikroskopa se razlikuje po tem, da naenkrat osvetlimo le izbrano rezino vzorca, kar močno izboljša kontrast slike in omogoča tridimenzionalno slikanje. To dosežemo z dvema zaslonkama, postavljenima v goriščnih ravninah. Konfokalna mikroskopija se navadno uporablja v kombinaciji s fluorescentno mikroskopijo za opazovanje bioloških vzorcev. V kombinaciji s fluorescentnimi označevalci pridobimo odličen kontrast z dobro razločljivimi podrobnostmi bioloških vzorcev, ki s presevno mikrosopijo ni dosegljiv.

Vsebina

Zgodovina

Prvi konfokalni mikroskop je sestavil Marvin Minsky leta 1955, a je bilo pridobivanje tridimenzionalne slike s premikanjem vzorca zelo počasno. V šestdesetih letih je Mojmír Petráň razvil prvi komercialni konfokalni mikroskop, ki je za hitrejše pridobivanje slike uporabljal Nipkowov disk. Leta 1969 sta M. David Egger in Paul Davidovits prvič opisala konfokalni mikroskop, ki je za osvetljevanje vzorca uporabljal laserski snop. Leta 1985 sta White in Amos predstavila uporabniku prijazen inštrument za tridimenzionalno lokalizacijo fluorescentnih označevalcev na osnovi konfokalnosti: prvi fluorescentni konfokalni mikroskop. Ta se je v devetdesetih letih 20. stoletja pričel s pridom uporabljati v biologiji in znanosti o materialih. Na osnovi konfokalne mikroskopije se razvili mnogo mikroskopskih tehnik, ki ponujajo dober vpogled v biološke vzorce.

Osnovni princip konfokalne mikroskopije

Za razliko od optičnih mikroskopov, kjer osvetljujemo celoten vzorec hkrati, s konfokalnim mikroskopom omejimo osvetljevanje vzorca na le eno točko v goriščni ravnini. Shema presevnega konfokalnega mikroskopa je sledeča. Vpadno svetlobo pred vpadom na lečo omejimo z režo. Na ta način ustvarimo točkovni izvor svetlobe in omejimo zbiranje svetlobe na ustrezno točko v goriščni ravnini, kamor postavimo opazovani vzorec. Simetrično glede na vzorec postavimo enako lečo in zaslonko na ustreznih razdaljah, tako da gorišče druge leče pade v režo druge zaslonke. S tem dosežemo, da svetimo na tisto ravnino, iz katere svetlobo zajemamo. Ime konfokalni oz. sožariščni mikroskop tako izhaja iz tega, da gorišči sovpadata. Brez druge reže bi zajemali svetlobo tudi iz drugih ravnin vzorca, osvetlitvi katerih se tudi pri fluorescentnem vzbujanju ne moremo izogniti. Zaradi tega dodatnega vzbujanja je pri klasični presevni mikroskopiji dobljena slika zamegljena, pri konfokalnem mikroskopu pa svetlobo iz izvengoriščnih ravnin odstranimo z drugo režo.

Shema presevnega konfokalnega mikroskopa. Reži omejita vzbujanje in zaznavanje na točno določeno ravnino (polna zelena črta). Druga reža služi zaustavljanju svetlobe iz vzbujenih izvengoriščnih ravnin (črtkana zelena črta).
Enlarge
Shema presevnega konfokalnega mikroskopa. Reži omejita vzbujanje in zaznavanje na točno določeno ravnino (polna zelena črta). Druga reža služi zaustavljanju svetlobe iz vzbujenih izvengoriščnih ravnin (črtkana zelena črta).

Fluorescentna konfokalna mikroskopija

Shema fluorescentnega konfokalnega mikroskopa
Enlarge
Shema fluorescentnega konfokalnega mikroskopa

Izraz konfokalni mikroskop se navadno uporablja za kombinacijo konfokalnega mikroskopa s fluorescentnim. Molekule, na katere vežemo fluorescentne označevalce, osvetljujemo s svetlobo izbrane valovne dolžine. Fluorescentni označevalci izsevajo svetlobo pri daljši valovni dolžini (na skici zelena) kot svetloba, s katero nanje svetimo (na skici modra). Polprepustno zrcalo na sredini je izbrano tako, da svetlobo z valovno dolžino izvora odbije, svetlobo fluorescentnih označevalcev pa prepusti. Svetloba izvora preide prvo zaslonko, se na polprepustnem zrcalu odbije in v vzorcu vzbudi fluorescentno svetlobo. Ta je čez polprepustno zrcalo prepuščena in čez drugo zaslonko vpade na kamero. Zaslonki ležita v ustreznih goriščnih ravninah. V sistem lahko dodamo še dva filtra, ki ju postavimo za izvor in pred detektor in s tem svetlobo še dodatno omejimo na točno določeno območje valovnih dolžin. Tako izboljšamo kontrast, saj poleg filtracije signala iz izvengoriščnih ravnin s konfokalnima režama odstranimo še signal ostalih molekul, ki niso označene s fluorescentnimi označevalci in jih ne želimo opazovati. Na ta način postanejo označene biološke strukture zelo dobro vidne.

Svetlobni vir

Ena možnost za izbiro izvora, s katerim osvetljujemo vzorec, je laser, ki je koherenten in monokromatski izvor svetlobe. Monokromatski pomeni, da sveti le pri eni valovni dolžini. Druga možna izbira izvora je širokopasovni izvor, ki ima valovne dolžine svetlobe porazdeljene preko celotnega vidnega dela spektra valovnih dolžin in je prostorsko nekoherenten na skali, na kateri opazujemo vzorec. Kot širokopasovni izvori se uporabljajo: izvor na volframovo nitko, kvarčna halogenska luč ali obločne luči različnih elementov (ksenon, živo srebro, ogljik). Tako laserski kot širokopasovni izvor morata biti čim manj koherentna, da se izognemo popačenju slike zaradi interference med svetlobo, ki jo zaznavamo, in svetlobo, ki se siplje na optičnih elementih. Ker je laser izvor koherentne svetlobe, moramo pred vpadom na optične elemente njegovo svetlobo napraviti nekoherentno.

Nastanek slike

Pri konfokalnem mikroskopu zajamemo svetlobo iz le ene točke ravnine, pri čemer smo odstranili nepotrebno ozadje signala iz izvengoriščnih ravnin. Za zajem celotne rezine vzorca je treba zajeti vsako točko ravnine, kar lahko storimo na dva načina. Način zajema slike je odvisen od izbire vira.

Laserski zajem

Vrstični zajem slike.
Enlarge
Vrstični zajem slike.

Z laserskim snopom se pomikamo vzdolž vrstic in pridobimo sliko vsake točke posebej. Tako vrstično zajamemo sliko celotnega vzorca. Postopek pridobivanja celotne slike traja med 0.5 s in 2 s. Starejši mikroskopi so premikali mizo z vzorcem prek celotnega vidnega polja. Pri modernejših izvedbah je miza z vzorcem pri miru, kar je za opazovanje bioloških vzorcev mnogo primernejše. V tak sistem je treba dodati še dve zrcali, ki ju postavimo med polprepustno zrcalo in vzorec, in ju nadzorujemo prek dveh sinhroniziranih galvanometrov. S tema zrcaloma izberemo osvetljevano točko v ravnini.

Konfokalni disk

Konfokalni disk
Enlarge
Konfokalni disk


Pri konfokalnih mikroskopih s širokopasovnim izvorom uporabimo drug način zajema. Svetlobo na točno določeno točko usmerimo s konfokalnim diskom, znanim tudi pod imenom Nipkowov disk. Tak način zajema je mnogo hitrejši, saj zajem slike traja le 1 ms, in je primeren za spremljanje dinamičnih procesov.

Konfokalni disk je plošča s spiralno razporejenimi luknjicami, skozi katere lahko hkrati osvetlimo in zajamemo več točk iz izbrane ravnine. Konfokalni disk postavimo za polprepustno zrcalo, tako da svetloba, s katero vzbujamo, in svetloba, s katero zajamemo sliko, potujeta skozi isto konfokalno režo in imata isto optično pot. S tem zagotovimo, da bosta ravnini, v kateri vzbujamo in zaznavamo, res sožariščni. Ko enkrat presvetlimo konfokalni disk, pridobimo sliko z več točk ravnine vzorca, ne pa z vseh točk. Celotno ravnino vzorca posnamemo tako, da disk postopoma vrtimo. Celotno ravnino vzorca posnamemo po polnem obratu diska.

Zajem več rezin

Informacijo iz preostalih ravnin pridobimo s spreminjanjem gorišča ali pa s spreminjanjem lege vzorca v navpični smeri. Z ustrezno programsko opremo iz zajema več zaporednih rezin rekonstruiramo tridimenzionalno sliko vzorca.

Ločljivost

Pri konfokalni mikroskopiji lahko govorimo o ravninski (lateralni) in navpični (aksialni) ločljivosti, ki sta omejeni z uklonsko limito. V ravnini lahko dosežemo ločljivost do 200 nm, kar je približno enako dolžini večjih nanocevk. V navpični smeri dosežemo ločljivost okrog 500 nm, kar je najmanjša debelina plasti, ki smo jo sposobni razločiti v optimalnih pogojih.

Ločljivost je omejena z valovno dolžino vpadne svetlobo in numerično aperturo leče. Na ločljivost vplivajo tudi poravnava optičnih elementov, odprtost konfokalne reže in lastnosti vzorca.

Primerjava posnete fluorescence brez konfokalnega diska (modra črta) in s konfokalnimi diskom (rdeča črta). Slika, posneta s konfokalnim diskom, ima opazno boljši kontrast.
Enlarge
Primerjava posnete fluorescence brez konfokalnega diska (modra črta) in s konfokalnimi diskom (rdeča črta). Slika, posneta s konfokalnim diskom, ima opazno boljši kontrast.

Vdorna globina

Vdorna globina je globina, iz katere smo še sposobni zaznati signal, opazno večji od ozadja. Močno je odvisna od medija, v katerem je vzorec, in tipa fluorescentnih molekul, s katerimi vzorec označimo. Največja globina, ki jo lahko dosežemo, je reda 1 mm za polprepustne vzorce in približno 100 μm za nepropustne vzorce. Polprepustni vzorci so vzorci, ki jih lahko presvetlimo in opazujemo svetlobo, ki vzorec preide na drugo stran, nepropustni vzorci pa svetlobe ne prepuščajo.

Uporaba

Uporablja se v biologiji, fizikalni kemiji, mikrobiologiji, nevroanatomiji, nevrofiziologiji in številnih drugih področjih. Nekatere izmed raziskovalnih področij so študija zarodnih celic, hibridizacija DNA ter uporaba membranskih in ionskih označevalcev.

Konfokalni mikroskop je v kombinaciji s fluorescentnimi označevalci ena od vodilnih metod, ki se uporabljajo za proučevanje bioloških vzorcev. Eden od razlogov je dejstvo, da so celice sestavljene iz fosfolipidnih membran, v katere z lahkoto vgradimo fluorescentne označevalce. Z njimi označimo izbrane strukture v vzorcu in jih s tem ločimo od okolice. Laserski zajem slike omogoča boljšo navpično resolucijo, zajem s konfokalnim diskom pa s svojo hitrostjo zajema omogoča spremljanje dinamičnih procesov v vzorcu.

Kot slikovna tehnika ima odlično resolucijo, ki da podrobne informacije o zgradbi tkiv in dinamiki določenih bioloških procesov. Uporablja se tudi kot spektroskopska tehnika, s katero analiziramo lokalno kemijsko okolico posameznih delov bioloških objektov. Iz meritev spektra svetlobe, ki jo izsevajo fluorescentni označevalci, lahko določimo tip lokalnih medmolekulskih interakcij.

Napredne tehnike

Večfotonska fluorescenca in večfotonska fluorescenca s konfokalnim mikroskopom (Multi Photon Confocal Fluorescence Microscopy): Vzorec vzbujamo s svetlobo z dvakrat daljšo valovno dolžino (vsak foton take svetlobe ima pol manj energije), kot je potrebna za običajno vzbujanje vzorca. Za vzbuditev vsake od fluorescirajočih molekul v tem primeru potrebujemo dva fotona, kar omeji vzbujanje vzorca na točko, kjer je intenziteta svetlobe največja. Na ta način se vzbujanje lokalizira, kar močno izboljša kontrast. Konfokalni način le še prispeva k dodatnemu izboljšanju kontrasta.

Vpad stimulirane emisije (STED - Stimulated Emission Depletion) je ena od tako imenovanih super ločljivostnih tehnik, pri katerem z ločljivostjo sežemo pod uklonsko limito. Pri tej tehniki svetlobo vzbujenih molekul v vzorcu zadušimo povsod, razen v gorišču posebej v ta namen skonstruirane leče.

Svetlobno aktivirana lokalizacija (PALM - PhotoActivated Localization Microscopy) in stohastično aktivirana optična rekonstrukcija (STORM - Stohastic Optical Reconstruciton Microscopy) sta prav tako super ločljivostni tehniki. Obe temeljita na lokalizaciji posameznih fluorescentnih označevalcev. Pri obeh tehnikah zajamemo več slik na istem mestu v nekaj zaporednih kratkih časovnih intervalih. Podatke nato računalniško obdelamo, pri čemer upoštevamo Gaussovsko porazdelitev zaznavanih fotonov, s čimer uspemo lokalizirati fluorescentni označevalec na območje, ki je manjše od ukonske limite.

Fluorescenca pri totalnem odboju (TIRFM - Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy): Pri tej tehniki izkoriščamo evanescetno polje, ki se širi v snov, če vzorec osvetljujemo pod kotom, večjim od kota totalnega odboja. Vpadni žarek se od vzorca odbije, evanescetno polje pa v tanki plasti vzbudi fluorescenco. Ker dobimo signal le iz plasti, debele okrog 10 nm, je ločljivost izboljšana mnogo pod uklonsko limito. Ker evanescetno polje pojema eksponentno z globino, smo s to tehniko omejeni na opazovanje vzorcev debeline 100-200 nm, oz. pri debelejših vzorcih na opazovanje njihove površine. Tudi to je ena izmed super resolucijskih tehnik.


Zajem življenjskega časa fluorescence (FLIM - Fluorescence Lifetime Imaging): Ta tehnika je drugačna od zgoraj naštetih, saj namesto intenzitete svetlobe merimo življenjski čas fluorescence. To je čas, ki ga vzorec porabi, da potem, ko nanj posvetimo s kratkim močnim sunkom svetlobe tudi sam sunkoma zasveti. S tem zmanjšamo vpliv sipanja svetlobe na tkivu in posledično izboljšamo kontrast na sliki.


Večfotonska fluorescentna mikroskopija
Enlarge
Večfotonska fluorescentna mikroskopija
PALM mikroskopija
Enlarge
PALM mikroskopija
STED mikroskopija. Primerjava s sliko konfokalnega mikroskopa
Enlarge
STED mikroskopija. Primerjava s sliko konfokalnega mikroskopa
FLIM mikroskopija
Enlarge
FLIM mikroskopija

Glej tudi

Viri

Osebna orodja